熒光定量PCR分析儀（qPCR儀）憑借其高靈敏度、高特異性和實時監(jiān)測能力，已成為分子生物學領域的關(guān)鍵技術(shù)，在基因表達分析方面具有重要應用。

qPCR通過檢測目標基因在mRNA水平上的表達量，結(jié)合內(nèi)參基因（如GAPDH、β-actin）進行標準化，消除樣本間RNA提取效率、逆轉(zhuǎn)錄效率等差異，實現(xiàn)基因表達的相對定量。

差異表達分析：比較不同處理條件（如藥物處理、環(huán)境刺激）或不同發(fā)育階段（如胚胎發(fā)育、細胞分化）下目標基因的表達變化。例如，研究炎癥因子在巨噬細胞激活前后的表達差異。
疾病機制研究：通過檢測腫瘤組織與正常組織中癌基因（如EGFR、HER2）或抑癌基因（如p53）的表達量，揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制。
藥物作用機制：分析藥物處理后細胞中特定基因（如凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2）的表達變化，評估藥物療效及作用靶點。

 

實驗流程：從樣本處理到數(shù)據(jù)獲取的關(guān)鍵步驟

樣本采集與處理
組織/細胞樣本：迅速裂解細胞或組織，提取總RNA（需避免RNA降解，可使用RNase抑制劑）。
血液樣本：分離外周血單核細胞（PBMC）或血漿，檢測循環(huán)腫瘤細胞（CTC）或循環(huán)游離DNA（cfDNA）中的基因表達。
逆轉(zhuǎn)錄（RT）
將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用隨機引物或基因特異性引物。逆轉(zhuǎn)錄效率需通過內(nèi)參基因驗證，確保cDNA質(zhì)量。
qPCR反應體系配置
引物與探針設計：引物需跨越內(nèi)含子（避免基因組DNA污染），探針需與目標序列完全匹配?？赏ㄟ^NCBI Primer-Blast或OligoArchitect等工具設計。
反應條件優(yōu)化：調(diào)整退火溫度、Mg²?濃度、引物濃度等參數(shù)，確保擴增效率在90%-110%之間（通過標準曲線斜率計算）。
上機運行與數(shù)據(jù)采集
使用96孔或384孔板，設置陰性對照（無模板對照，NTC）和陽性對照。運行程序包括預變性、循環(huán)擴增（40-50個循環(huán)）和熔解曲線分析（SYBR Green法）。